以下是小鼠肺微血管内皮细胞的提取步骤：
1.实验动物：选用健康的小鼠，一般为清洁级或SPF级，6-8周龄，体重根据品系有所差异，通常在18 - 22g左右。提前将小鼠置于适宜的饲养环境（温度22-25℃，湿度50%-60%，12h光照/12h黑暗循环）中适应1-2天。

2.实验试剂：无菌PBS（磷酸盐缓冲液）,(启达生物，货号：SD0029)
0.1%-0.2%（w/v）胶原酶Ⅱ溶液
ECGM-M内皮细胞培养基（启达生物，货号：P1001-M）
红细胞裂解液（启达生物，货号：SD0063）
细胞包被液(启达生物，货号：SD0044)

3.实验器材：
手术器械：包括眼科剪、眼科镊、手术刀等，需提前高压灭菌处理。
培养皿、离心管、移液管、滴管等：均需为无菌一次性用品。
细胞筛：孔径为70μm和40μm，用于过滤组织悬液，去除较大的组织碎片。
离心机：用于细胞的离心沉淀。
培养箱：设置温度为37℃，含5%CO₂的饱和湿度环境，为细胞提供适宜的生长条件。

提取步骤
1.小鼠处死与取材：
将小鼠用颈椎脱臼法或过量麻醉剂（如戊巴比妥钠，剂量为50-100mg/kg体重）处死，迅速将其仰卧固定于解剖板上。

用75%酒精消毒腹部皮肤，沿腹部正中线剪开皮肤和腹壁，暴露胸腔。

用眼科剪小心剪开胸腔，充分暴露心脏和肺脏。

用注射器经右心室向肺动脉内注入约5ml无菌PBS，直至肺脏变白，以冲洗掉肺内的血液。

用眼科剪小心剪下肺脏，放入盛有预冷无菌PBS的培养皿中，轻轻漂洗2-3次，去除表面的血迹和杂质。

2.组织剪碎与消化：
将漂洗后的肺脏转移至新的无菌培养皿中，用眼科剪将肺组织剪成约1mm³的小块。

将剪碎的肺组织块转移至离心管中，加入适量的胶原酶Ⅱ溶液（每克肺组织约加入5-10ml），轻轻混匀。

将离心管用封口膜密封好置于37℃水浴中消化30-60min，期间每隔5-10min轻轻振荡一次，使消化充分。

3.细胞悬液制备：
消化结束后，将离心管取出，800-1000r/min离心5 - 10min，弃去上清液。

向沉淀中加入适量的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温静置5-10min，以裂解红细胞。

再次800-1000r/min离心5min，弃去上清液。

用适量的内皮细胞培养基重悬沉淀，然后依次通过70μm和40μm的细胞筛，去除较大的组织碎片，得到单细胞悬液。

4.细胞接种与培养：
将单细胞悬液转移至离心管中，800-1000r/min离心5 min，弃去上清液。

用适量的内皮细胞培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度至（1 -2）×10^6cells/ml。

将细胞悬液接种于预先包被有明胶或纤连蛋白的培养瓶或培养板中，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。

培养12小时后，轻轻倒掉培养液，用无菌PBS轻轻漂洗2-3次，去除未贴壁的细胞，然后加入新鲜的内皮细胞培养基继续培养。


后续观察与鉴定
1.细胞观察：
在培养过程中，每天在倒置显微镜下观察细胞的生长状态和形态，记录细胞的贴壁情况、生长速度、形态变化等。正常的肺微血管内皮细胞呈铺路石样外观。

2.细胞鉴定：
培养至细胞融合度达到70%-80%时，可进行细胞鉴定。常用的鉴定方法包括免疫荧光染色检测内皮细胞特异性标志物（如CD31、vWF等）、摄取乙酰化低密度脂蛋白（Ac - LDL）等。

以上步骤仅为一般的小鼠肺微血管内皮细胞提取方法，实际操作中可根据具体实验要求和实验室条件进行适当调整。

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提取步骤